分析葡萄3种葡萄卷叶伴随病毒RT—PCR检测论文结论

分析葡萄3种葡萄卷叶伴随病毒RT—PCR检测论文结论

文章导读:号(GLRaV-3)的检出率为100.0%,葡萄卷叶伴随病毒1号(GLRaV-1)的检出率为17.1%,葡萄卷叶伴随病毒2号(GLRaV-2)的检出率为11.0%;病毒混合侵染的样品占总检测样品数的28.1%,其中葡萄卷叶伴随病毒l号、3号混合侵染样品占总检测样品数的17.1%,葡萄卷叶伴随病毒2号、3号混合侵染的样品占总检测样品数的11.0%,且在这些被病毒混合侵染
摘要 2010-2011年我们对河北省涿鹿、怀来、昌黎、宣化等县(区)以及北京市葡萄卷叶病的发生情况进行了调查,并对采集的葡萄植株样品用RT-PCR方法检测病毒种类。在检测的82个样品中,葡萄卷叶伴随病毒3号(GLRaV-3)的检出率为100.0%,葡萄卷叶伴随病毒1号(GLRaV-1)的检出率为17.1%,葡萄卷叶伴随病毒2号(GLRaV-2)的检出率为11.0%;病毒混合侵染的样品占总检测样品数的28.1%,其中葡萄卷叶伴随病毒l号、3号混合侵染样品占总检测样品数的17.1%,葡萄卷叶伴随病毒2号、3号混合侵染的样品占总检测样品数的11.0%,且在这些被病毒混合侵染的样品中,有2个样品被葡萄卷叶伴随病毒1号、2号、3号三重侵染。

  关键词 葡萄卷叶病 葡萄卷叶伴随病毒1号 葡萄卷叶伴随病毒2号 葡萄卷叶伴随病毒3号 RT-PCR

  葡萄卷叶病是葡萄上发生最普遍、危害最严重的病毒病害之一。症状表现常因葡萄品种、环境条件、发病时间及年份的不同而异,一般是从葡萄植株基部叶片开始发病,叶缘向下反卷,逐渐向上部叶片发展。红色葡萄品种感病后叶肉在秋季正常变红之前变红,并随着时间的推移逐渐变为暗红色,但叶脉仍然保持绿色(图版2);****品种感病后叶色不变红,但叶肉变黄或叶缘颜色变浅,叶脉有轻微褪绿。该病通常可导致葡萄减产30%~50%,使葡萄可溶性固形物含量下降28.7%,严重影响葡萄产量和品质。目前至少已发现10种葡萄卷叶伴随病毒(GLRaVs)与该病相关,其中葡萄卷叶伴随病毒1号、2号、3号是与该病相关的3种最重要的病原物,这3种病毒均属长线形病毒科(Closteroviridae),由于其基因组为正单链RNA,且在葡萄树中病毒含量通常较低,因此逆转录一聚合酶链式反应(RT-PCR)以其灵敏度高、特异性强的特点在这3种病毒检测中应用广泛。

  我国是葡萄生产大国,河北省涿鹿、怀来、昌黎、宣化等县(区)及北京市是华北地区重要的葡萄栽培基地,关于葡萄卷叶伴随病毒1号、2号、3号在葡萄植株中的感染情况还未见报道。为此,我们采用RT-PCR方法,检测了河北省和北京市葡萄园3种主要葡萄卷叶伴随病毒的发生情况,旨在为国家管理和规范苗木生产市场、健全相关的检疫制度进行葡萄卷叶病防控提供理论依据。现将结果报道如下。

  1 材料与方法

  1.1试验材料

  以已知感染葡萄卷叶伴随病毒1号的1份采自辽宁的葡萄样品和感染葡萄卷叶伴随病毒2号、3号的葡萄样品作为阳性对照(保存在本实验室)。RNase抑制剂、DNA聚合酶(附带缓冲液)、DNA分子量、dNTP购自TaKaRa公司,反转录酶(附带缓冲液)购自Promega公司,RNA提取试剂盒(EASYspin plant RNA extracting kits)为博迈德公司(Biomed)的产品,琼脂糖为Sigma公司产品,其他试剂均为国产分析纯试剂。

  1.2试验方法

  1.2.1样品采集

  分别于2010、2011年8-10月在北京市通州区葡萄大观园,河北省怀来县桑园镇、张家口市宣化区观后村和葡萄研究所基地、涿鹿县温泉屯乡和东小庄乡、昌黎县昌黎镇采集样品。试验共调查17个葡萄园,葡萄卷叶病发生均十分严重。试验共采集82个样品,涉及44个品种,品种包括赤霞珠、蛇龙珠、品丽珠、霞多丽、梅鹿辄、烟73等酿酒葡萄品种,红地球、无核白鸡心、美人指、白马奶、维多利亚、红光无核、龙眼等鲜食葡萄品种。其中在北京市通州区葡萄大观园采集的样品主要是鲜食葡萄品种,在河北省各县(区)采集的葡萄品种主要为酿酒葡萄品种。对每个葡萄园每个葡萄品种随机采集具卷叶症状叶片1~2份,采回的样品及时保存在-40℃冰箱中。

  1.2.2检测引物

  根据已发表的文献合成葡萄卷叶伴随病毒1号、2号、3号的检测引物。引物名称、序列、退火温度及扩增片段大小如表1所示。

  1.2.3总RNA提取

  提取葡萄叶柄韧皮部组织(100mg)在加液氮条件下研磨成粉末,并将粉末转移到1.5mL的离心管中,然后用RNA提取试剂盒按照使用说明书进行总RNA提取。

  1.2.4RT-PCR检测病毒

  先将RNA反转录成cDNA,每个反应体系为20μL。先在1.5mL的离心管中加入4μL总RNA作为模板,1μL反向引物(R1、R2或R3)和5.7μLDEPC处理水,混匀,先在70℃水浴5min,后在冰上放置5min,再加入4μL5×buffer缓冲液、4μLdNTP、0.5μLRNase抑制剂(40U/μL)和0.8μLM-MLV反转录酶(200U/μL),于42℃反应1h合成cDNA。

  反转录后即进行PCR扩增,在每25μL的扩增体系中,包括2μLcDNA、2.5μL10×buffer缓冲液、2μLdNTP、各0.5μL的5′和3′引物(20μmoL/L)、0.2μLDNA聚合酶(5U/μL)及17.3μLddH2O。PCR反应条件:95℃预变性5min,95℃变性30s,退火30s(退火温度详见表1),72℃延伸30s,40个循环,最后72℃延伸10min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。

  2 结果与分析

  2.1病毒RT-PCR检测

  以已知葡萄卷叶伴随病毒1号单独侵染和葡萄卷叶伴随病毒2号、3号双重侵染的葡萄样品为阳性对照进行RT-PCR检测(图1)。为了进一步确定检测结果,我们还将葡萄卷叶伴随病毒1号、2号、3号各3~5个RT-PCR反应原液直接送测序公司测序,然后将测序结果在NCBI上进行比对分析。分析结果表明这些扩增产物确实分别为这3种病毒的基因片段。

  2.2葡萄卷叶伴随病毒1号、2号、3号的检测结果

  2.2.1不同地区葡萄卷叶伴随病毒1号、2号、3号的检测结果

  对采集的82个样品进行了RT-PCR检测,并进行统计分析,按样品采集地点的统计结果见表2。采自北京市通州区20个样品,葡萄卷叶伴随病毒3号的检出率为100.0%,有3个样品除了检测出葡萄卷叶伴随病毒3号外,还检测出葡萄卷叶伴随病毒1号;有1个样品除感染葡萄卷叶伴随病毒3号外
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